掃描電鏡技術(shù)在動物毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)研究上的應(yīng)用

掃描電鏡技術(shù)在動物毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)研究上的應(yīng)用 
摘要：用6種不同的掃描電鏡樣品制備方法對動物毛發(fā)表面及橫斷面的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察比 較．結(jié)果表明：正常、清潔的動物毛發(fā)采用常規(guī)方法即可得到真實(shí)、清晰的超微結(jié)構(gòu)，而臟發(fā)和 受損毛發(fā)，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)那逑刺幚恚�有效除去覆蓋物，真實(shí)結(jié)構(gòu)才能完全顯示出來．6種方法 中用洗滌劑先清洗、無水丙酮浸泡4 h，結(jié)合超聲波清洗的方法清洗毛發(fā)樣品效果最好．頻閃儀| 測高儀| 測距儀| 金屬探測器| 試驗(yàn)機(jī)| 扭力計(jì)| 流速儀| 粗糙度儀| 流量計(jì)| 平衡儀|  

 現(xiàn)在已有大量文獻(xiàn)討論把毛發(fā)用于法庭科學(xué)， 診斷疾病以及評定營養(yǎng)狀況¨ ．毛發(fā)是哺乳動物 皮膚表皮部角質(zhì)層的衍生物，也是哺乳動物的三大 特征之一，所有動物的毛發(fā)都有其基本的形態(tài)和結(jié) 構(gòu)，而不同的動物在毛發(fā)形態(tài)上(如長短、粗細(xì)以及 色澤等)又表現(xiàn)出差異 J．毛發(fā)形態(tài)的差異必定與 其微觀結(jié)構(gòu)有著緊密的聯(lián)系，毛發(fā)的微觀結(jié)構(gòu)主要 取決于先天遺傳，典有物種的特異性，因此，毛發(fā)微 觀結(jié)構(gòu)也是人們多年來研究的重點(diǎn) J．人類對毛發(fā) 微觀結(jié)構(gòu)的認(rèn)識可以追溯到17世紀(jì)，但直到1837 年，Brewster首次應(yīng)用光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)毛發(fā)表面的 特異性結(jié)構(gòu)，才標(biāo)志著毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)研究的開 始 J，之后，有關(guān)毛發(fā)結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道大量涌現(xiàn) J，
20世紀(jì)50年代中期以后，毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)研究開始 擴(kuò)展到紡織行業(yè)、食性分析 和法醫(yī)科學(xué) ． 80年代，隨著電子顯微鏡在毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)研究中的 廣泛應(yīng)用，毛發(fā)的微觀結(jié)構(gòu)研究有了進(jìn)一步的完善 與發(fā)展 J，電子顯微鏡下，毛發(fā)結(jié)構(gòu)的圖像更加清 晰、精確，并且立體感強(qiáng)，分辨率高，可以從不同的角 度進(jìn)行觀察．但由于毛發(fā)存在有角原蛋白構(gòu)成的致 密的皮質(zhì)層⋯ ，而且容易附著皮脂腺分泌物、吸附 灰塵等，電鏡的分辨率又很高，采用傳統(tǒng)方法難以 獲得較好的效果．目前，毛發(fā)的電鏡樣品制備在國 內(nèi)外未見系統(tǒng)報(bào)道．本文采取幾種不同的掃描電鏡 制樣方法對動物毛發(fā)的外部形態(tài)和橫斷面特征進(jìn) 行觀察比較，以期為毛發(fā)的超微結(jié)構(gòu)研究提供最佳 的制樣方法．

1 材料與方法
1．1 試驗(yàn)材料 正常和受損小白鼠毛發(fā)由南京醫(yī)科大學(xué)提供．
1．2 試驗(yàn)儀器 GG1 12一HU超聲波清洗機(jī)，EMITECH K850 臨界點(diǎn)干燥儀，HITAcH E一1010噴金儀，菲利浦 SEM一505掃描電鏡．
1．3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將正常毛發(fā)和受損毛發(fā)分別用鋒利刀片切成適 當(dāng)長度的小段，采用以下6種不同方法制備樣品． 方法I 將毛發(fā)粘臺、噴金，掃描電鏡觀察表 面和橫斷面． 方法Ⅱ 無水丙酮浸泡毛發(fā)樣品4 h，取出粘 臺、噴金，掃描電鏡觀察表面和橫斷面． 方法Ⅲ 無水丙酮浸泡毛發(fā)樣品4 h，其間超 聲波清洗兩次，取出粘臺、噴金，掃描電鏡觀察表 面和橫斷面． 方法Ⅳ 洗滌劑清洗毛發(fā)樣品之后，無水丙 酮浸泡4 h，其間超聲波清洗兩次，取出粘臺、噴 金，掃描電鏡觀察表面和橫斷面． 方法V 毛發(fā)用洗滌劑清洗之后，無水丙酮 浸泡4 h，其間超聲波清洗兩次，3％ 戊二醛固定2 h，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，取出粘臺、噴金，掃 描電鏡觀察表面和橫斷面． 方法Ⅵ 毛發(fā)用無水丙酮浸泡6 h，其間超聲 波清洗3次，取出粘臺、噴金，掃描電鏡觀察表面 和橫斷面．2 結(jié)果與分析 毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)一般由毛鱗片層、毛皮質(zhì)層和 毛髓質(zhì)層構(gòu)成(少數(shù)除外)．毛鱗片層很薄，位于毛 發(fā)的最外面，毛皮質(zhì)層是由退化的死細(xì)胞致密排 列而成，呈無結(jié)構(gòu)的均質(zhì)狀，毛髓質(zhì)層是由氣腔和 氣腔壁構(gòu)成．
(1)正常組毛發(fā)表面整潔、無附著物，直接粘 臺、噴金，掃描電鏡觀察到圓柱狀毛桿上覆蓋著一 薄層毛小皮，呈疊瓦狀排列，形似鱗片，層次清晰整 齊；斷面毛皮質(zhì)層和毛髓質(zhì)層結(jié)構(gòu)清晰，無覆蓋物， 見圖1—1，2．而對于有些臟發(fā)特別是受損毛發(fā)，表 面不整潔，易附著皮脂腺分泌物以及糜爛物等污 物，方法I雖然簡單易行，但其真實(shí)的結(jié)構(gòu)被附著物 掩蓋，圖1—3，4中，毛發(fā)表面和斷面都有大量的覆 蓋物，鱗片層難以看見，斷面結(jié)構(gòu)模糊，因此，這類毛 發(fā)需要先清洗以除去污物．由于本試驗(yàn)中正常的毛 發(fā)比較干凈，進(jìn)行常規(guī)制備即可觀察到真實(shí)結(jié)構(gòu)， 而受損毛發(fā)表面覆蓋物較多，因此方法Ⅱ至Ⅵ 主 要對受損毛發(fā)的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、比較．
(2)方法Ⅱ 使用丙酮浸泡4 h，但收效甚 微，見圖1—5，6，覆蓋層依然清晰可見，圖6中的 橫斷面上有一些碎屑狀物存在．
(3)方法Ⅲ 在丙酮浸泡期間，借助超聲波 清洗，取得了一定成效，有些毛段能清洗干凈，有 些毛段還可見污物存在，圖1—7所取的一段毛發(fā) 上可見受損毛發(fā)的鱗片層出現(xiàn)紊亂排列，甚至重 疊翹起，圖1—8的斷面結(jié)構(gòu)能看出毛皮質(zhì)層和毛 髓質(zhì)層，但看不到圖1—2中的孑L腔結(jié)構(gòu)．
(4)方法Ⅳ 先用洗滌劑洗去部分污物，再結(jié) 合丙酮和超聲波清洗，去污效果相當(dāng)好，發(fā)現(xiàn)圖1— 9中的受損毛發(fā)，毛鱗片排列紊亂不規(guī)整，有的鱗片 稍翹起，有的斷裂或有缺口，多分布在游離端，較少 波及基部，有些區(qū)域毛小皮排列疏松，個(gè)別鱗片狀 小皮皺縮．?dāng)嗝嫫秸�、清晰，毛皮質(zhì)層和毛髓質(zhì)層結(jié) 構(gòu)分明，無覆蓋物，孑L腔清晰可見，見圖1—10．
(5)方法V 在方法Ⅳ 的基礎(chǔ)上，對毛發(fā)進(jìn) 行了固定、脫水和臨界點(diǎn)干燥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與方法Ⅳ 沒有顯著區(qū)別．
(6)方法Ⅵ 中丙酮浸泡時(shí)間過長，毛發(fā)表面 出現(xiàn)大量突起、凹陷以及鱗片脫落，局部膨大，說 明毛發(fā)結(jié)構(gòu)受到影響和腐蝕，見圖l—ll，l2．

3 結(jié)論與討論
3．1 毛發(fā)樣品的清洗處理 本試驗(yàn)中，正常組毛發(fā)比較干凈、無附著物， 常規(guī)制備方法即方法I可得到真實(shí)、清晰的結(jié)構(gòu)． 由此可見，干凈的毛發(fā)進(jìn)行常規(guī)制備即可．而受損 組毛發(fā)有較多覆蓋物，掩蓋了毛發(fā)的結(jié)構(gòu)． 臟發(fā)特別是受損毛發(fā)的前期清洗處理至關(guān)重 要，否則難以見到廬山真面目．因其表面附著有皮 脂腺分泌物、灰塵等污物，遮蓋了毛發(fā)的真實(shí)結(jié) 構(gòu)，普通的水洗難以除去，所以，必須采用既有效 又不損傷毛發(fā)結(jié)構(gòu)的清洗方法，才能觀察到毛發(fā) 的真實(shí)結(jié)構(gòu)，為疾病診斷，法醫(yī)鑒定，分類等提供 科學(xué)的依據(jù)．本試驗(yàn)中的方法V，洗滌劑清洗毛發(fā) 之后，適當(dāng)時(shí)間的丙酮浸泡，結(jié)合超聲波清洗，效 果很好，適用于較臟毛發(fā)的掃描電鏡樣品的制備． 但丙酮浸泡時(shí)問不宜過長，否則會破壞毛發(fā)本身 的結(jié)構(gòu)，如方法Ⅵ的結(jié)果．
3．2 毛發(fā)樣品橫斷面的切取 由于毛發(fā)的基本成分主要是角質(zhì)蛋白，角質(zhì) 蛋白由氨基酸組成．氨基酸提供了毛發(fā)生長所需 的營養(yǎng)成分．各種原纖維通過螺旋式、彈簧式的結(jié) 構(gòu)相互纏繞交聯(lián)，形成角質(zhì)蛋白的強(qiáng)度和柔韌度， 故而毛發(fā)具有一定的剛韌性．針對毛發(fā)這種特性， 必須要使用鋒利刀片，動作穩(wěn)而準(zhǔn)，用力要均勻， 才能切出較平整的斷面，否則會因參差不齊而掩 蓋真實(shí)的斷面結(jié)構(gòu)．
3．3 毛發(fā)樣品的導(dǎo)電處理 毛發(fā)樣品本身不導(dǎo)電，需要在掃描電鏡觀察 之前進(jìn)行導(dǎo)電處理．合適的導(dǎo)電處理能夠提高掃 描電鏡分析中的圖像質(zhì)量，最大限度地避免樣品 的失真和變形等問題¨ ．導(dǎo)電膜應(yīng)該是均勻和連 續(xù)的，膜太厚，會因蒸發(fā)時(shí)問長而使試樣受熱損 傷，用掃描電鏡觀察時(shí)，容易產(chǎn)生龜裂以及掩蓋試 樣表面細(xì)節(jié)；膜太薄，試樣表面各個(gè)部分膜厚顯著 不均，掃描電鏡觀察時(shí)，常會產(chǎn)生局部荷電¨引．一般采用離子濺射技術(shù)對樣品表面鍍膜效果較好． 離子濺射法可以實(shí)現(xiàn)對樣品不需作任何旋轉(zhuǎn)而在 樣品各個(gè)面上形成平坦連續(xù)的覆蓋層，這是因?yàn)?被濺射出來的靶原子在相對較高的氣壓環(huán)境中， 其所形成的覆蓋層顆粒細(xì)小而均勻，能產(chǎn)生高分 辨率的電鏡圖像，另外濺射覆蓋層的厚度相對于 真空噴涂來說也容易控制．因此，采用離子濺射法 對樣品實(shí)施鍍膜，產(chǎn)生的電鏡圖像細(xì)膩、清晰度高．對于毛發(fā)，因其質(zhì)地相對較硬，結(jié)構(gòu)細(xì)微，金離 子濺射的厚度宜薄，但要均勻、連續(xù)，否則會掩蓋 一些細(xì)節(jié)，影響到結(jié)果分析．