以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組

摘要：基因組學(xué)新近的進(jìn)展為生物學(xué)的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了巨大的機(jī)遇，抓住這個(gè)機(jī)遇需要新穎的試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及高通量的數(shù)據(jù)收集和分析系統(tǒng)。隨著基因分析系統(tǒng)的靈活性和綜合能力的增強(qiáng)，能夠進(jìn)行單細(xì)胞和單分子檢測(cè)、適用于整個(gè)基因組、并且能夠高通量的產(chǎn)生和處理巨大的數(shù)據(jù)平臺(tái)的構(gòu)建成為一種重要的趨勢(shì)。由Wisconsin-Madison, WI大學(xué)構(gòu)建Optical Mapping（可見圖譜）系統(tǒng)便是這些新穎的平臺(tái)之一，它能夠以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組。

　　基因組學(xué)新近的進(jìn)展為生物學(xué)的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了一個(gè)巨大的充滿機(jī)遇的舞臺(tái)。抓住這個(gè)機(jī)遇需要新穎的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、高通量的數(shù)據(jù)收集和分析系統(tǒng)以及富有創(chuàng)造性的方法去解決以前難以理解的問題。隨著基因分析系統(tǒng)的靈活性及綜合能力的增強(qiáng)，能夠進(jìn)行單細(xì)胞和單分子檢測(cè)、適用于整個(gè)基因組、并且能夠高通量的產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)平臺(tái)的構(gòu)建正在成為一種重要的趨勢(shì)。Optical Mapping（可見圖譜）系統(tǒng)(University of Wisconsin-Madison, WI)作為這類新穎平臺(tái)的一例，能夠以每次一個(gè)分子的方式研究整個(gè)基因組。 電阻計(jì) | 紅外線測(cè)溫儀 | 紅外線溫度計(jì) | 頻譜分析儀 | 鉤表 | 多功能測(cè)試儀 | 電容表 | 記錄儀 | 色度計(jì) | 剝線鉗 | 電壓計(jì) | 濁度計(jì) | 溫濕度記錄儀
　　Optical Mapping 系統(tǒng)通過收集單個(gè)分子的圖譜形成整個(gè)基因組的物理圖譜。而這些物理圖譜在基因組中能夠反映特殊DNA 序列的位置以及它們之間的物理距離。在插入、刪除、倒置、復(fù)制、顛換和重排方面，它們所進(jìn)行的表征和比較對(duì)基因組非常有用^[1]。通過創(chuàng)造性地結(jié)合DNA 分子的預(yù)處理和操作、表面化學(xué)、高速數(shù)據(jù)收集成像以及一系列的選擇性處理過程，OpticalMapping 便產(chǎn)生出物理圖譜，這些物理圖譜的特征便是能為基因組學(xué)長(zhǎng)期存在的問題提供新的解決辦法。例如，Optical Mapping 的單分子檢測(cè)功能使得它可以對(duì)不同種類的群體進(jìn)行基因水平上的分析，比如實(shí)性瘤(solid tumor)內(nèi)或者在細(xì)菌菌落里的分子的檢測(cè)。從細(xì)胞中提取出的DNA 分子可直接成像，而不需要擴(kuò)增和亞克隆步驟。因此基因的每一部位都可經(jīng)Optical Mapping直接觀測(cè)，使得這一系統(tǒng)成為一個(gè)真正的全基因方法。就此而言，Optical Mapping 系統(tǒng)與那些建立在整個(gè)染色體上進(jìn)行基因比較的低分辨率的細(xì)胞遺傳方法具有相似之處。但是，OpticalMapping 的分辨率可以達(dá)到幾萬個(gè)堿基，這使得該方法適合于低分辨方法辨基因型方法未曾被探索過的領(lǐng)域的研究。分辨率在幾千個(gè)堿基的全基因分析方法開啟了以前難以解決的基因變異問題之門，例如：對(duì)中等到大的片段插入和缺失的檢測(cè)和翻譯。更重要的是，通過Optical Mapping 檢測(cè)基因組多態(tài)性不需要預(yù)先知道諸如基因的類型、位置等信息，使得這一方法成為名副其實(shí)的“發(fā)現(xiàn)型方法”。最后，Optical Mapping系統(tǒng)的通量相當(dāng)于在90min 內(nèi)收集代表一個(gè)人基因組的數(shù)據(jù)，如此大的通量也使得對(duì)于大范圍群體的研究成為可能。在那種條件下，通過疾病敏感性和藥物響應(yīng)性基因座位鑒定的相關(guān)研究，整個(gè)人類基因組的全部變異都能被直接區(qū)分。下文中，作者會(huì)通過詳細(xì)地描述Optical Mapping 系統(tǒng)，列舉出該技術(shù)應(yīng)用的典型實(shí)例，并把該技術(shù)置于現(xiàn)有基因分析平臺(tái)之中來詳細(xì)闡述Optical Mapping 的特點(diǎn)。

　　在Optical Mapping 中，大的基因組DNA分子（300-3000kb 堿基）直接從細(xì)胞中提取、延伸，并通過結(jié)合微流控芯片技術(shù)^[2]和帶正電的玻璃表面與帶負(fù)電的DNA 骨架之間的靜電相互作用使其固定在被特殊處理的玻璃表面上(圖1)。這種固定化技術(shù)相當(dāng)精妙，以至限制性內(nèi)切酶仍很容易接近DNA分子，而且產(chǎn)生的限制型片段也能得到很強(qiáng)的保留�？汕懈�6000~45000 個(gè)堿基對(duì)的限制性內(nèi)切酶能夠用于制作高分辨率的物理圖譜。熒光染料YOYO－1能夠標(biāo)記表面上的DNA骨架，其形成的單分子圖譜的納米陣列可通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。

　　不管亞微觀的DNA 分子的實(shí)際寬度是多少，熒光顯微鏡的數(shù)值放大功能使得DNA 分子的寬度有一個(gè)明顯的增加，這樣，被拉長(zhǎng)的單鏈DNA 分子可很容易地通過標(biāo)準(zhǔn)的63×物鏡觀測(cè)到。大的、被拉長(zhǎng)的DNA 分子的性質(zhì)與拉長(zhǎng)的彈簧相似，當(dāng)它們緊緊黏附在限制性內(nèi)切酶上，只有分子的末端保持松弛狀態(tài)，各個(gè)分子之間便形成可以識(shí)別的1~2μm 的間隙。與大多數(shù)的熒光系統(tǒng)通過添加探針分子進(jìn)行標(biāo)記不同，Optical Mapping 以分子間熒光的消失作為標(biāo)記。添加的探針分子通常會(huì)在標(biāo)簽周圍產(chǎn)生模糊圖案（由于傳統(tǒng)的探針非特異雜交），產(chǎn)生相應(yīng)的噪音。而這種方法不僅可以避免噪聲的產(chǎn)生，也省去了后續(xù)的探針去除步驟。由于限制性內(nèi)切酶具有特異性好和可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，Optical Mapping 可以保證物理圖譜形成過程簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。
　　快速數(shù)據(jù)收集通過一個(gè)可測(cè)定納米陣列OpticalMapping 的面積的成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。與其他物理圖譜方法不同，Optical Mapping 不需要知道碎片大小和序列信息。通過測(cè)量已知大小的DNA分子總的熒光強(qiáng)度，基于熒光強(qiáng)度隨堿基對(duì)的變化即可以得到Optical Mapping 的碎片大小。盡管DNA 分子輪廓長(zhǎng)度發(fā)生了變化，熒光強(qiáng)度仍保持一致，使得碎片大小測(cè)量仍很準(zhǔn)確。由于D N A 碎片通過靜電作用被固定在玻璃表面上，因此可實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子限制性圖譜的繪制。
　　所有的單分子圖譜組合在一起形成一個(gè)包含整個(gè)染色體的圖譜，這一過程類似于序列的組裝。與其他物理圖譜不同，全基因Optical Mapping，又稱“一致”圖譜，綜合了成千上萬的單分子圖譜�！耙恢隆眻D譜上一個(gè)典型的基因座位覆蓋了10~70 個(gè)單分子圖譜。這么大的覆蓋率使得Optical Mapping 比起其他的物理圖譜技術(shù)有更高的準(zhǔn)確性^[3-9]。由于每個(gè)DNA 分子都能產(chǎn)生一系列離散的數(shù)據(jù)（限制性酶切碎片圖譜），因而任何一個(gè)（或者每一個(gè)）DNA 分子產(chǎn)生的數(shù)據(jù)相當(dāng)于瓊脂糖凝膠上的一條完整的帶或者微陣列中的一個(gè)點(diǎn)（見表1 ）。這樣，Optical Mapping 系統(tǒng)在一塊芯片上產(chǎn)生一系列大量的類似數(shù)據(jù)，該方法的準(zhǔn)確性和精確性已被上千次的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
　　根據(jù)分析的目的，“一致”圖譜和單分子Optical Mapping 都可以通過硅片雜交定位到相應(yīng)的序列。就像掃描條形碼鑒定物質(zhì)一樣（圖2），通過掃描限制性碎片形成的Optical Mapping 圖案（而不是在硅片上的圖譜的圖案）鑒定圖譜相應(yīng)的序列，進(jìn)而可指認(rèn)其在基因上的位置。在微陣列雜交試驗(yàn)中，堿基之間的氫鍵反映相應(yīng)的目標(biāo)和參考序列的匹配性，熒光強(qiáng)度的偏差表征多態(tài)性區(qū)域。同樣，在硅片雜交中限制性碎片之間的得分可以反映Optical Mapping 和硅片圖譜匹配的程度，而得分減少可表征多態(tài)性區(qū)域。硅片雜交的參數(shù)能被調(diào)整，從而使Optical Mapping 的條形碼與序列準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)起來，但是也能很自由地檢測(cè)染色體的區(qū)別。

2 應(yīng)用

2.1 從源頭進(jìn)行基因組的構(gòu)建

　　基因組測(cè)序依賴于精確的物理圖譜來形成和驗(yàn)證序列數(shù)據(jù)^[1]。傳統(tǒng)的全基因物理圖譜通過酶切代表性的人工細(xì)菌染色體文庫(kù)（BAC），以及綜合產(chǎn)生的限制性片段組合成對(duì)應(yīng)的基因組序列。現(xiàn)有技術(shù)如“高信息量指紋圖譜“（HICF）^[10]極大地改進(jìn)了以BAC 為基礎(chǔ)的物理圖譜的分辨率和準(zhǔn)確度�？墒且訠AC 為基礎(chǔ)的技術(shù)由于對(duì)橋連大的局部重復(fù)的DNA 分子有困難，需要深入的染色體文庫(kù)構(gòu)建，并且單個(gè)樣品需要很大的勞動(dòng)強(qiáng)度，因而使得這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)被部分掩蓋。
　　Optical Mapping 不僅不存在上述問題，而且極大地簡(jiǎn)化了物理圖譜的形成過程。HICF 形成的指紋圖譜沒有碎片的序列信息，只是在一個(gè)克隆過程中形成的大量的無序碎片。大的DNA 分子被酶切成規(guī)則的并具有豐富信息的限制性碎片，而并非簡(jiǎn)單的指紋圖譜。
　　Optical Mapping 除了用于表2 給出的基因組研究外，也被用于輔助其他測(cè)序過程，及對(duì)一些生物的基因水平研究（耐輻射球菌、惡性瘧原蟲、大腸桿菌、白色念珠菌、紅螺菌、鼠疫桿菌、弗氏志賀氏菌、海鏈藻、利什曼原蟲等）^{[3,6,7,11-15]}。這些研究證實(shí)了通過Optical Mapping 系統(tǒng)構(gòu)建物理圖譜的精確性和穩(wěn)定性。

2.2 發(fā)現(xiàn)插入缺失的比較基因組學(xué)研究

　　Optical Mapping 系統(tǒng)不需要預(yù)先知道基因組的序列或結(jié)構(gòu)，因此能很方便地比較相關(guān)的種類和分析來自同一物種中不同成員的多形態(tài)基因組。最近， 未經(jīng)測(cè)序的Shigella flexneri Y血清型菌株的Optical Mapping 被構(gòu)建出來，并與已測(cè)序的Shigella菌株的硅片圖譜進(jìn)行比較。在未測(cè)序的Y 血清型菌株中發(fā)現(xiàn)了明顯的刪除現(xiàn)象，包括葡糖轉(zhuǎn)移酶gtrII、gtrAI 和gtrBI，這些轉(zhuǎn)移酶可能包含在血型的變化過程中^[13]。近來的研究強(qiáng)調(diào)基因改變過程中的插入和刪除作用（ i n d e l s ）^[16] 。用于檢測(cè)indels 的完善系統(tǒng)還處于研究的初期，而推測(cè)indels 在人類基因組學(xué)中的作用和影響基于高分辨率或者低分辨率的基因組學(xué)方法。Optical Mapping 對(duì)人類基因組學(xué)的重要貢獻(xiàn)便是發(fā)現(xiàn)了indels以及其他相似的現(xiàn)象如倒置、置換、復(fù)制和重排等，而其他高通量的基因組學(xué)平臺(tái)很難達(dá)到如此高的分辨率。

2.3 基因組異常的完善檢測(cè)方法

　　比較基因組雜交技術(shù)（CGH）和代表性的低聚核苷酸微陣列分析技術(shù)（ROMA）采用DNA 微陣列檢測(cè)微生物和哺乳動(dòng)物基因組中DNA 拷貝數(shù)目的改變（圖3）^[17,18]，這些方法也能夠檢測(cè)復(fù)制和刪除的存在�？墒牵�這些現(xiàn)象確切的本質(zhì)還不很清楚。擴(kuò)增區(qū)的基因位置不能明確地被標(biāo)識(shí)出來，特別是哺乳動(dòng)物的基因組，低分辨率的CGH 和ROMA 不能準(zhǔn)確地測(cè)定斷裂點(diǎn)的位置。此外，染色體中基因組外物質(zhì)的移位和插入不能被完全檢測(cè)。盡管脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）^[19]能夠檢測(cè)到諸如轉(zhuǎn)移等反�，F(xiàn)象，但是對(duì)哺乳動(dòng)物的基因組則需要預(yù)先知道斷裂點(diǎn)及其DNA 印跡；然而低等真核生物能以denono 模式直接檢測(cè)染色體的異�，F(xiàn)象。另一方面，Optical Mapping 系統(tǒng)能夠直接分析這些異常的染色體，并且可精確檢測(cè)和定位基因斷裂點(diǎn)的位置，闡明遷移過程??通過成對(duì)的單分子限制性圖譜或者條形碼而非參考基因組。單分子圖譜本質(zhì)上講是雜交的圖譜而非硅片圖譜，它們通過序列數(shù)據(jù)構(gòu)建而成，這些很像硅片DNA 印跡法，只不過這些探針用于校準(zhǔn)或者雜交過程。與所有的限制性圖譜一樣，已完成的Optical Mapping 的分辨率很容易通過選擇限制性內(nèi)切酶的切割頻次來調(diào)整。

3 結(jié)論

　　Optical Mapping 正從根本上迅速改變基因分析的方法和結(jié)果。該技術(shù)的特點(diǎn)??諸如單分子檢測(cè)、高通量、全基因研究的策略，為基因組學(xué)研究開辟了新的“ 戰(zhàn)場(chǎng)”。未來的研究工作將集中在人類基因組的Optical
Mapping，以及改進(jìn)該系統(tǒng)，增加其適應(yīng)性方面。例如，由于Optical Mapping的底物分子仍具有生物學(xué)活性，經(jīng)探針標(biāo)記的二級(jí)雜交能被利用產(chǎn)生全基因范圍基礎(chǔ)上的外遺傳現(xiàn)象。發(fā)展“ 可見測(cè)序（Optical Sequencing）”會(huì)對(duì)單分子Optical Mapping 圖3 全基因方法分析基因失常。普通的染色體異常實(shí)例以及通過PFG分析、基因微陣列、Optical Mapping 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法產(chǎn)生杠桿作用，從而使分辨率降低到幾個(gè)堿基對(duì)的水平^[20,21]。越來越多基因信息的發(fā)現(xiàn)，更多的問題也會(huì)產(chǎn)生。作者非常樂觀地認(rèn)為Optical Mapping 系統(tǒng)能在將來探索和解決這些問題過程中做出貢獻(xiàn)。