一種應(yīng)用于液相色譜分析和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜分析的微型分散器

一種應(yīng)用于液相色譜分析和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜分析的微型分散器
摘要: 一種含有聚合物整體柱且能夠調(diào)節(jié)液滴的壓電裝置用來將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的洗脫液點樣到基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）樣品靶上進行肽段指紋圖譜分析。牛血清白蛋白（BSA）酶解肽段經(jīng)過液相梯度洗脫后可以提高序列覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定的可信度。 

　　肽段指紋圖譜（PMF）是一種基于肽段質(zhì)量檢測的蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜技術(shù)，常用于藥物靶點和生物標記物發(fā)現(xiàn)的差異表達分析中[1,2]。PMF實驗的效率與蛋白質(zhì)酶解肽段片段被鑒定的數(shù)目相關(guān)。當(dāng)細胞和組織的量受限制時，在樣品中的蛋白質(zhì)濃度降低的同時保證蛋白質(zhì)鑒定的可信是目前研究的挑戰(zhàn)之一。由于高低豐度分析物離子的競爭造成肽段檢測數(shù)目降低的問題更加嚴重[3,4]，這將引起離子抑制以及減少低豐度肽段和蛋白質(zhì)的檢測數(shù)量，從而降低目標蛋白質(zhì)的序列覆蓋率。在質(zhì)譜分析中，微型液相色譜（LC）分離可以明顯地提高肽段和蛋白質(zhì)樣品的檢測靈敏度[5-7]。液相色譜分離技術(shù)可以將高低豐度的蛋白質(zhì)分開，降低檢測過程中的離子抑制效應(yīng)[8]，從而可以提高目標蛋白質(zhì)的序列覆蓋率。多樣的微型液相色譜分離模式可以單獨運行也可以與其他如親和捕獲、離子交換、體積排阻色譜聚焦和反相色譜模式聯(lián)用[9-11]。  氣體分析儀 | 泄露氣體檢測儀 | 頻譜分析儀 | 沼氣檢測儀 | 聲級計 | 多用表 | 濁度計 | 電導(dǎo)計 | 電源供應(yīng)器 | 溫濕度儀 | 測距儀 | 示波表 | 鉗子 | 照度計 | 可燃氣體檢測儀 | 電力測量儀 | 溫濕度記錄儀
　　PiezoLC（MicroFab Technologies, Inc., Plano, TX, 專利申請中）是一種微量噴射進樣系統(tǒng)，用其可以將經(jīng)色譜分離的微量體積（0.1~100 nL）蛋白質(zhì)酶解肽段點到基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）的樣品靶上供后續(xù)的質(zhì)譜分析。一種多孔的聚合物整體材料固定在玻璃毛細管的噴射分散裝置上用來進行肽段的色譜分離。這些肽段樣品首先進樣到整體色譜柱上（反相基質(zhì)），然后洗脫緩沖液流經(jīng)色譜柱時將肽段洗脫分離。洗脫的肽段以液滴的形式從壓電的裝置孔出來，點到MALDI-TOF-MS的樣品靶盤上，仍然保留著色譜分離后的狀態(tài)。肽段將在一定時間后進行多重分析。
　　PMF分析中，蛋白質(zhì)和肽段的量往往受到限制，需要微型化的流體操作技術(shù)。PiezoLC噴射進樣裝置采用一根聚合物整體柱并且只需要很少體積（<10μL）的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物。甲基丙烯酸基質(zhì)的聚合物分離材料不需要填充顆粒填料和篩板，很難被整合到微小流速的裝置中并且會干擾液流[12]。大孔聚合物整體材料的反壓低，這對于系統(tǒng)分散裝置來說極其重要。通過紫外光引發(fā)聚合可以為整體柱固定形狀和位置。多種化學(xué)物和功能單體可以被整合到一根整體柱上，如強陽離子交換（SCX）和反相（RP）。不僅如此，這些色譜柱具有的快速傳質(zhì)能力，使得其具有強大而快速的分離能力[13]。 
　　PiezoLC裝置是一種非常有用的工具，能夠從有限的樣品中對蛋白質(zhì)進行鑒定和表征。PMF應(yīng)用實驗中肽段采用噴射系統(tǒng)進樣進行色譜分離后可以明顯地降低離子抑制效應(yīng)并且提高MALDI-TOF-MS的分辨率。對牛血清白蛋白（BSA）的酶解產(chǎn)物進行分離分析時，與對照組相比，該方法鑒定了大量的肽段，具有非常高的氨基酸序列覆蓋率，提高了蛋白質(zhì)鑒定的可信度。 
1 方法 
1.1 BSA溶液的酶解 
　　BSA蛋白質(zhì)溶液酶解過程按照Kinter等人[14]的方法進行。將蛋白質(zhì)與20μg的胰蛋白質(zhì)酶（Promega, Madison, WI）混合后在37 ℃條件下反應(yīng)過夜。 
1.2 整體柱的制備 
　　（1）硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管乙烯化。整體聚合物（丁基甲基丙烯酸-乙烯二甲基丙烯酸） 毛細管柱按照Lee 等人[15]的方法制備。PiezoLC硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管的內(nèi)表壁需要乙烯化用來共價連接整體聚合物。 
　　（2）混合物的聚合。乙烯化的硼硅酸鹽基質(zhì)的玻璃毛細管利用不透光的絕緣帶掩蓋并充滿以下聚合混合物：16%（v/v）乙烯二甲基丙烯酸，24%（v/v）丁基甲基丙烯酸，59%（v/v）1-正癸醇以及1.0%（v/v）2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。充滿聚合混合物的毛細管在ELC 4001（Electro-Lite Corp., Danbury, CT） 365 nm 15 mW/cm2 紫外燈下照射15 min。反相聚合物整體材料的孔徑經(jīng)測定為2.2μm。
　　（3）PiezoLC微型分散裝置的構(gòu)建。含有整體材料的玻璃毛細管裝配到PiezoLC微型分散進樣裝置中（見圖1）。不同的整體柱位置對應(yīng)于不同的分散孔進行了多種分散測試。在液滴形成和分散過程中干擾最小的整體柱在毛細管中的位置如圖2所示。 

1.3 洗脫實驗 
　�。�1）基質(zhì)溶液。將重結(jié)晶的α-CHCA（α-cyano-α-hydroxycinnamic acid）（LaserBio Labs, Sophia-Antipolis, France）溶解于350 g/L溶液中，其中含有等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇和乙腈（Sigma-Aldrich）。利用帶有55μm噴射孔（PN MJ-AT-01-55, MicroFab Technologies, Inc.）的PiezoLC微型分散進樣裝置，將含有0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）的α-CHCA溶液沉積在不銹鋼的MALDI樣品靶盤上（PN DE1271TA，Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD），每個點為100 nL。 
　　（2）色譜柱上樣。PiezoLC裝置用200μL 70%（v/v）乙腈和0.1%（v/v）TFA沖洗，然后再用200μL 0.1%（v/v）TFA沖洗。BSA的酶解產(chǎn)物（50 fmol/μL）上樣到柱上，然后再用200μL 0.1%（v/v）TFA沖洗。
　�。�3）梯度洗脫。梯度洗脫程序為濃度每次變化5%，從5%增加到70%。這一過程采用包含等量的1-丙醇、甲醇、1-丁醇、乙腈（Sigma- Aldrich）溶液和0.1%（v/v）TFA溶液（EBD1洗脫緩沖液）來實現(xiàn)。每個洗脫步驟以6.0μL/min的流速將體積為100 nL的洗脫液過量的上樣到12 個基質(zhì)靶點。以70%的EBD1作為洗脫緩沖液時等度洗脫的BSA酶解產(chǎn)物作為參照。 
　�。�4）MALDI-TOF-MS和PMF。在反射模式下進行MALDI-TOF-MS分析實驗，所用儀器為Axima CFR MALDI-TOF質(zhì)譜儀（Shimadzu Scientific Instruments），每個樣品點100張譜圖，并且每張圖10個激光點疊加產(chǎn)生。光譜通過質(zhì)量為1439.811 7 Da和2 045.027 9 Da的兩個肽段進行內(nèi)標校正。峰形平滑方法為Savitsky-Golay法，其帶有梯度質(zhì)心峰抓取方法。將利用Axima軟件生成的單一同位素質(zhì)量產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，上載到MASCOT PMF搜索軟件中進行分析[16]。SwissProt數(shù)據(jù)庫搜索時采用多種修飾（脲甲基半胱氨酸修飾）并且其肽段質(zhì)量容忍度為±0.2 Da。 
2 結(jié)果 

2.1 MALDI-TOF-MS譜圖 
　　 圖3顯示的是所有從PiezoLC裝置中經(jīng)每個臺階梯度洗脫下來的BSA酶解產(chǎn)物的MALDI-TOFMS譜圖，其采用的梯度條件為5%~70%的EBD1 洗脫液。 

　　在對照組的等度洗脫中，序列覆蓋率和被鑒定的肽段數(shù)分別為30%和17。采用臺階梯度PiezoLC分離的同樣量的BSA酶解產(chǎn)物，得到的結(jié)果為序列覆蓋率為56%，總共鑒定出38個肽段（圖4）。與對照組相比，該方法的序列覆蓋率提高了87%，鑒定的肽段數(shù)提高了124%。在50%，55%，65%和70%的臺階洗脫中經(jīng)MASCOT軟件搜索后沒有發(fā)現(xiàn)明顯的與BSA蛋白質(zhì)相對應(yīng)的肽段。這些結(jié)果與其他的PiezoLC BSA產(chǎn)物洗脫實驗的結(jié)果一致。 

3 結(jié)論  

　　一種含有聚合物整體柱且能夠根據(jù)需要點樣的裝置用來將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的洗脫液點樣到MALDI-TOF-MS樣品靶上進行PMF分析。經(jīng)過臺階梯度洗脫方法對BSA酶解產(chǎn)物進行LC分離分析時可以提高序列覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定的可靠性。這種微型方法非常有利于PMF的蛋白質(zhì)酶解樣品分析中低濃度的蛋白質(zhì)的PMF分析，為蛋白質(zhì)組樣品分析提供了新的裝置。