顯微成像光譜儀技術(shù)的研究及應(yīng)用

顯微成像光譜儀技術(shù)的研究及應(yīng)用
摘要：顯微成像光譜儀技術(shù)足一種生物組織檢測方法，目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學檢測和疑難病癥分析，已成為組 織檢測領(lǐng)域的研究熱點。論述r顯微成像光譜儀各結(jié)構(gòu)功能模塊的工作原理及特點，并時其各主要技術(shù)指標進行了分 析。介紹了目前的發(fā)展現(xiàn)狀，并對所出現(xiàn)的多種顯微成像光譜儀的技術(shù)方案及特點做了詳細的總結(jié)。研究結(jié)果表明，顯 微成像光譜技術(shù)作為一種新的技術(shù)手段，必將在l臨床醫(yī)學、生物學、材料學以及分析化學等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

 l 引 言 近些年來，生物醫(yī)學一直是國際上的熱點研究 領(lǐng)域，而生物技術(shù)的飛速發(fā)展也對新型先進顯微觀 測技術(shù)的研究提出了越來越高的要求。自從熒光顯 微鏡出現(xiàn)以后，尤其是在1957年自Marvin Minsky 把共焦顯微技術(shù)引入熒光觀測領(lǐng)域以來，共焦熒光 顯微鏡技術(shù)就以其獨有的特點一直在生物組織研究 中發(fā)揮著重要作用l1]。自20世紀80年代成像光譜 儀技術(shù)出現(xiàn)以來，光學成像技術(shù)與光譜技術(shù)得到了 有機地結(jié)合，它不僅能對物體進行形貌成像，而且還 能提供豐富的光譜信息。由于它具有高光譜分辨 率、多譜段、圖譜合一等優(yōu)點，所以在遙感領(lǐng)域獲得 了巨大的成功 J。 最近幾年，國際上開始出現(xiàn)了將熒光顯微技術(shù) 與成像光譜交叉的～種新的研究方向，即顯微成像 光譜技術(shù)。由于它在獲得樣品結(jié)構(gòu)圖像信息的同時 可獲得超高細分的光譜信息，也就是說可以得到樣 品信息的數(shù)據(jù)立方體，包括一維的光譜信息和兩維 的空間信息，所以為生物醫(yī)學分析、礦物質(zhì)研究和發(fā) 光材料微結(jié)構(gòu)分析提供了更加豐富的信息量，這在 生物、醫(yī)學、化學、材料學等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價 值。由于顯微成像光譜儀的獨特優(yōu)點，最近幾年在 國際上得到了廣泛的研究。在國內(nèi)，南開大學、天津 大學、西安光機所、長春光機所和上海技術(shù)物理研究 所等也都開展了這方面的研究 作【3__ J。

2 顯微成像光譜儀的定義和功能模塊 顯微成像光譜儀技術(shù)是在普通的 微技術(shù)的基 礎(chǔ)上引入目前發(fā)展迅速的成像光譜理論而得到的一 種新型的光學探測技術(shù)。它的工作原理如圖l所 示。主要包括光源、顯微機構(gòu)、光譜成像機構(gòu)、掃描 (推掃)機構(gòu)和后續(xù)計算機處理五個模塊。由光源發(fā) 出的光，經(jīng)濾光片、反射鏡、顯微物鏡后照射在樣品 上。激發(fā)的熒光或樣品 表面的反射光再次通過 顯微物鏡、反射鏡、半透 半反鏡進入成像光譜儀， 最后成像在成像光譜儀 的像面CCD上，經(jīng)計算 機讀出數(shù)據(jù)和光譜、圖像 圖l 顯微成像光 譜儀結(jié)構(gòu)原理圖 找 物 f 重構(gòu)程序進行處理，得到所需要的目標圖像和光譜 圖。計算機操控樣品臺上下和左右移動，以實現(xiàn)樣 品的三維掃描成像。
主要功能模塊及其特點：
(1)光源模塊。光源模塊是用來照明樣品使其 產(chǎn)生反射或激發(fā)樣品使其產(chǎn)生熒光。照明方式可分 為透射式和反射式兩種。根據(jù)分析樣品的不同需要 選擇不同的光源。在照明樣品探測吸收光譜時，一 般選用Hg燈等寬譜段光源。在激發(fā)樣品探測熒光 光譜時，要根據(jù)激發(fā)樣品所需的光源波段的不同選 擇單色儀或激光器作為激發(fā)光源。
(2)顯微模塊。顯微模塊實現(xiàn)對樣品的空間分 辨，一般選擇普通顯微光學系統(tǒng)。近年來，為了提高 探測熒光圖像的空間分辨率，激光掃描共焦熒光顯 微系統(tǒng)也得到了極大的應(yīng)用。
(3)成像光譜模塊。成像光譜模塊主要實現(xiàn)儀 器的光譜分光。目前采用的分光方式主要分為色散 分光和干涉分光。色散型是一種傳統(tǒng)的分光方式， 技術(shù)上比較成熟，已經(jīng)得到了大量的應(yīng)用。但其能 量利用率比較低。干涉型分光方式，尤其是傅里葉 變換成像光譜儀，由于它具有高光譜分辨率、高能力 利用率、多通道的特點，所以取得了飛速的進展，成 為了成像光譜研究領(lǐng)域的新熱點。
(4)掃描(推掃)模塊。顯微成像光譜儀結(jié)構(gòu)是 通過計算機操控樣品臺進行移動的。利用樣品臺的 平動實現(xiàn)對樣品的推帚成像；利用樣品臺的上下移 動，實現(xiàn)對樣品的斷層掃描成像。為了獲得準確的 光譜圖像，必須對樣品臺的掃描(推掃)機構(gòu)的運動 速度進行精確的設(shè)計、控制。一般通過計算機控制 步進電機來驅(qū)動樣品臺的精確運動。
(5)后續(xù)計算機處理模塊。后續(xù)處理模塊包括 數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)定標、數(shù)據(jù)重構(gòu)三個系統(tǒng)。數(shù)據(jù)采集 系統(tǒng)指的是對(xD 探測器數(shù)據(jù)的讀出、采集、傳輸、 控制、存儲和實時顯示等。數(shù)據(jù)定標指的是通過測 定成像光譜儀對一個已知輻射特性目標的響應(yīng)，得 到儀器的儀器函數(shù)，從而可根據(jù)成像光譜儀所獲取 的數(shù)據(jù)準確得到所觀察目標的超光譜圖像信息。數(shù) 據(jù)鶯構(gòu)系統(tǒng)是指對數(shù)據(jù)進行變換等處理，實現(xiàn)對數(shù) 據(jù)的三維重構(gòu)，獲得可視化的樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像信 息和光譜分布信息。

3 主要技術(shù)指標 顯微成像光譜儀技術(shù)是成像光譜技術(shù)與顯微技 術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，因此它的一些技術(shù)指標是相互制約 和相互綜合的結(jié)果。顯微成像光譜儀系統(tǒng)的主要指 標的確定需要考慮系統(tǒng)的綜合性能和兩分系統(tǒng)相互 制約等因素。
(1)光譜范圍。光譜范圍主要根據(jù)處理的樣品 特性和分光方式而定，一般根據(jù)反射光吸收光譜的 范圍或所激發(fā)的熒光光譜的范圍來確定系統(tǒng)的工作 光譜范圍。
(2)譜段數(shù)。譜段數(shù)的選取主要根據(jù)CCD面陣 相機的光譜像元數(shù)的多少而定，沒有嚴格的標準。 但對采用傅里葉變換干涉儀的分光系統(tǒng)來說，為了 能實現(xiàn)快速傅里葉變換(FFT)和提高數(shù)據(jù)處理速 度，一般選擇譜段數(shù)為2的整數(shù)次冪
(3)空間分辨率�？臻g分辨率主要由顯微物鏡 的數(shù)值孔徑、放大倍率和CCD像元大小而定。在采 用激光掃描共焦熒光顯微系統(tǒng)中，空間分辨率可比 普通顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高大約1．4倍。
(4)光譜分辨率。光譜分辨率主要與分光系統(tǒng) 的設(shè)計有關(guān)。在色散型分光系統(tǒng)中，光譜分辨率與 分光計的狹縫寬度有關(guān)。狹縫越窄，光譜分辨率越 高，但系統(tǒng)的光能利用率隨之降低，因此一般在保證 足夠光通量的前提下，減小狹縫寬度，以提高光譜分 辨率。在干涉型分光系統(tǒng)中，光譜分辨率與狹縫寬 度無關(guān)，只與系統(tǒng)的最大光程差有關(guān)。

4 顯微成像光譜儀設(shè)計原理及工作特點 隨著顯微成像光譜儀技術(shù)的飛速發(fā)展，世界各 國的科學家們研制了很多種采用不同技術(shù)手段的顯 微成像光譜儀方案。這些不同的技術(shù)手段主要集中 在光譜分光方式上。根據(jù)成像光譜中分光機理特點 的不同可以把它們分為兩類：一類是色散分光型，它 包括光柵型、棱鏡型和濾光片分光型；另一類是干涉 分光型，主要包括基于Michelson干涉儀的動鏡型 和基于變形Sagnac干涉儀的空間調(diào)制型。

4．1 基于光柵一棱鏡一光柵組合分光的顯微成像 光譜技術(shù) 圖2所示為上海技術(shù)物理研究所的研究人員設(shè) 計和研制的一種顯微高光譜成像儀的原理圖，它是 基于光柵一棱鏡一光柵分光方式的l9j。整個系統(tǒng)的光 譜范圍為400～800nm，譜段數(shù)為120個，光譜分辨 R2l 率小于5nm，空間分辨率可達到1．125／,m。 一CCD 抓測器 什 圖2 基于光柵．棱鏡一光柵組合分光 的顯微成像光譜儀結(jié)構(gòu)原理圖 處于顯微鏡載物臺上的樣品被柯勒照明系統(tǒng)照 明，瞬時視場內(nèi)的樣品條帶通過顯微鏡物鏡成像在 分光計的狹縫處，然后再經(jīng)過光譜分光組件后，在垂 直于樣品條帶方向按光譜色散，最后成像在CCD像 面上。CCD光敏面平行于狹縫的一維稱為空間維， 垂直于狹縫的一維稱為光譜維，在空間維每一行光 敏元上得到的是樣品條帶的一個光譜波段的像，面 陣CCD相機每幀圖像便對應(yīng)于一個樣品條帶的多 光譜圖像。通過載物臺自動裝置對樣品進行推掃， 就可得到整個樣品的二維圖像和光譜數(shù)據(jù)，即數(shù)據(jù) 立方體。 棱鏡、光柵分光是一種傳統(tǒng)的、技術(shù)發(fā)展比較成 熟的分光方式，基于棱鏡或光柵分光的光譜儀器的 主要缺點是系統(tǒng)信噪比受通光孑L、狹縫的限制，通光 孑L、狹縫越窄，光譜分辨率越高，但系統(tǒng)接收到的能 量也隨之降低。

4．2 基于線性可變?yōu)V光片的顯微光譜技術(shù) 圖3為一種基于 線性可變?yōu)V光片分光 的顯微成像光譜儀的 結(jié)構(gòu)原理圖。它由顯 微鏡、線性可變干涉 濾光片、微動平臺、 CCD攝像頭、圖像采 集卡和計算機六大部 分組成【10 J。其原理 是，由光源發(fā)出的光 圖3 基于線性町變?yōu)V光片 的熒光顯微成像光譜 儀的結(jié)構(gòu)原理圖 經(jīng)反射鏡和聚光鏡照明載物臺上的樣品，樣品的物 光經(jīng)過顯微物鏡、半透半反鏡、45。棱鏡和目鏡可供 人眼觀察，或通過成像物鏡和線性可變干涉濾光片 成像在CCD攝像頭的感光面上，CCD攝像頭的輸 出連接圖像采集卡，圖像采集卡連接計算機。 線性可調(diào)濾光片是一種新型的分光方式，這種 儀器的結(jié)構(gòu)設(shè)計比較簡單。目前存在的主要問題是 透光效率低、光譜范圍有限、光譜分辨率較低，另外 波長調(diào)諧時存在像移。

4．3 基于動鏡型干涉儀的顯微成像光譜技術(shù) 822 圖4足基于Michelmn動鏡型干涉儀的顯微成 像光譜儀的結(jié)構(gòu)原理圖。由樣品點出射的光，經(jīng)過 微物鏡和半透半反鏡進入Michelmn f：涉儀。由 于動鏡的循環(huán)往復運動，所以町在CCD探測器光敏 面上得到隨時問變 化的干涉圖，通過對 干涉圖的傅 葉變 換就可以復原出光 譜信息。 在該系統(tǒng)中，由 于系統(tǒng)的光譜分辨 罔4 基Ⅲ『Michelin動鏡型干涉 儀的娃微成像光譜儀結(jié)構(gòu)原理圖 率由系統(tǒng)的最大光程差決定，所以具有很高的光譜 分辨率。另外，由于它不含狹縫，光能利用率高。其 缺點是：由于動鏡只有循環(huán)運動一個周期后才能得 到一個完整的干涉圖對其進行變換處理，所以不適 于}央速變化的光潛測量；動鏡要求勻速運動，對傾 斜、晃動等參數(shù)要求很嚴格，所以該系統(tǒng)不適合應(yīng)用 于現(xiàn)場實地檢測。

4．4 基于Sagnac干涉儀的顯微成像光譜技術(shù) 圖 Sagnac 微成像 構(gòu)原理 統(tǒng)中，Sagnac干涉 5 藎于 g 涉儀的 儀通過分束器橫向 顯微成像光譜儀結(jié)構(gòu)原理圖 剪切每一束光線，得 到兩束互相平行且具有一定光程差的光線；在CCD 光敏面上將兩束光線收集在一個點上，根據(jù)相干特 性產(chǎn)生干涉圖；通過推掃載物臺，對每一行樣品進行 分析；最后再通過傅里葉變換復原出光譜信息。 在陔裝置中，由于沒有運動部件，因此具有良好 的穩(wěn)定性和可靠性，適合于野外現(xiàn)場工作；雖然它與 色散型分光方式一樣，都依靠一個狹縫來實現(xiàn)推掃 方向的空間分辨，但其光譜分辨率與狹縫寬度無關(guān)， 因此可以在空間分辨率允許的情況下，加寬狹縫，從 而增大視場角、提高能量利用率。該結(jié)構(gòu)的缺點是， 由于其光譜分辨率由最大光程差決定，而最大光程 差由沒計時橫向剪切儀的剪切量決定，因此限制了 該方案的光譜分辨率。

4．5 基于線陣針孔推掃的激光掃描共焦顯微成 像光譜儀LP．I~SMIS技術(shù) 如圖6所示，系統(tǒng)分為共焦顯微光學子系統(tǒng)和 空間調(diào)制型成像光潛光學子系統(tǒng)。線陣檢測針孔陣 列既位于共焦顯微子系統(tǒng)中的線陣光源針孔陣列的 共焦位置，又位于成像光譜子系統(tǒng)中的傅里葉透鏡 誘函～ 一孓 的前焦面，所以它既是 顯微系統(tǒng)的像面，又是 成像光譜系統(tǒng)的物面。 在線陣檢測針孑L位置 所成的樣品點的像被 分束器在傅里葉透鏡 的前焦面橫向剪切為 兩個虛像，它們經(jīng)過傅 里葉透鏡，最后被柱面 鏡在C(=I=)探測器上收 集，并發(fā)生干涉，得到 干涉圖。最后通過對 分柬器 罔6 基于線陣針孔推豐1的 激光掃描共焦顯微成像 光譜儀結(jié)構(gòu)原理 干涉圖的變換，復原出樣品點的光譜信息。 在該顯微成像光譜儀技術(shù)方案中，由系統(tǒng)得到 的干涉圖的強度分布為 r 』(A)= I‘B(v)co~rtvAdv √ I r = I B(v)cos(2~vd：r／．／ )dv (1) √ I 樣品點的光譜分布可由于涉圖強度分布的傅里葉變 換得到： r十／ B(v)= I，(A)co~rtvAdA J ～， r F， = I，(A)cos(2rtMx／f )dz5 (2) J 一， 在該方案中，線陣檢測針孑L陣列是其關(guān)鍵部件。 線陣檢測針孔陣列的離焦不僅會影響裝置的光譜分 辨率和空間分辨率，而且會極大地降低儀器的性能， 對由裝置獲取到的生物組織的光譜信息和圖像信息 的正確性產(chǎn)生影響。因此必須設(shè)計良好的調(diào)整和裝 配工具，盡可能的減少系統(tǒng)的離焦量，以期獲得理想 的干涉圖分布。 LP—L( MIS裝置相對于以前研究的顯微成像 光譜儀來說具有三個主要優(yōu)點：較高的光譜分辨率； 由于采用了掃描共焦顯微光學系統(tǒng)，相對于基于普 通顯微系統(tǒng)的顯微成像光譜系統(tǒng)來說，具有較高的 空間分辨率和軸向深度解析力，能重構(gòu)出組織內(nèi)部 的三維圖像，實現(xiàn)立體成像；由于采用了空間調(diào)制成 像光譜技術(shù)，相對于基于棱鏡、光柵和濾光片等分光 元件的色散型顯微成像光譜技術(shù)來說，能夠提供更 大的光通量，適合于弱光探測，這在生物醫(yī)學研究領(lǐng) 域顯得更為重要。

5 應(yīng) 用 雖然顯微成像光譜儀技術(shù)的研究工作是最近幾 年才開始興起的，目前尚處于探索性研究階段，但它 在很多領(lǐng)域已顯示出潛在的應(yīng)用前景。 生命科學是顯微成像光譜技術(shù)最具有影響力的 應(yīng)用領(lǐng)域。它可以廣泛應(yīng)用于染色體識別、癌癥診 斷、皮膚病榆查、細胞功能研究、蛋白質(zhì)相互作用研 究等許多方面。另外它還可以與多熒光探針標記分 析技術(shù)相融合，得到試樣更加豐富的信息。顯微成 像光譜技術(shù)在材料領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景，特 別是對發(fā)光材料的分析，例如Si基納米材料的研 究⋯J。在石油化工領(lǐng)域，它可以用于分析含油巖心 表面的熒光光譜信息和空間信息，研究巖心中的石 油運移，判斷原生油層【I2j。

6 結(jié)論 顯微成像光譜儀技術(shù)的出現(xiàn)在顯微領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了 圖像分析和光譜分析技術(shù)的有機結(jié)合，不僅具有空 間分辨能力，而且還具有光譜分辨能力。由于顯微 成像光譜技術(shù)所具有的獨特優(yōu)點，使其研究取得了 巨大的進展，出現(xiàn)r各種各樣的技術(shù)手段和方案。 分析了顯微成像光譜技術(shù)的各功能模塊及主要特 點，總結(jié)r其主要技術(shù)指標，并對目前出現(xiàn)的各種有 代表性的技術(shù)方案及其特點做了分析�？梢钥闯�， 顯微成像光譜技術(shù)作為一種新的技術(shù)手段，它必將 會在臨床醫(yī)學、生物學、材料學以及分析化學等領(lǐng)域 得到廣泛的應(yīng)用。